Após os eventos da Mansão Spencer (Resident Evil 1), Jill Valentine, ex-membro da força especial S.T.A.R.S., decide ficar em Raccoon City para investigar e expor os crimes da Umbrella Corporation. Mas antes que consiga sair da cidade com provas, o pior acontece: o T-Virus vaza e transforma a cidade num verdadeiro inferno zumbi.
Durante sua fuga, Jill se abriga numa delegacia parcialmente destruída e descobre que a Umbrella enviou um grupo paramilitar chamado U.B.C.S. (Umbrella Biohazard Countermeasure Service), supostamente para conter a situação. É nesse momento que ela conhece Carlos Oliveira, um dos poucos membros da U.B.C.S. ainda vivos, que parece ser um dos poucos com boas intenções.
Porém, o verdadeiro pesadelo começa quando Nemesis aparece: uma arma biológica gigantesca, rápida, forte e programada para matar todos os membros dos S.T.A.R.S. Ele persegue Jill ao longo do jogo, invadindo locais inesperados, destruindo paredes e matando tudo em seu caminho. A cada encontro com Nemesis, Jill fica mais debilitada e traumatizada.
Ao lado de Carlos, Jill descobre que a Umbrella pretende apagar todas as provas da tragédia detonando uma bomba nuclear na cidade. Eles então traçam um plano desesperado para escapar antes da destruição.
Em um ponto crucial da história, Jill é infectada pelo T-Virus após um ataque de Nemesis. Carlos assume o controle por um tempo e precisa encontrar a cura para salvá-la. Ele invade um hospital dominado por monstros e recupera o soro antiviral.
Após ser curada, Jill volta à ação e enfrenta Nemesis em suas formas mutantes. Em um laboratório subterrâneo, ela finalmente consegue derrotá-lo com uma arma experimental, encerrando sua perseguição uma vez por todas.
Pouco antes da bomba atingir a cidade, Jill e Carlos escapam a bordo de um helicóptero, enquanto assistem Raccoon City ser destruída por uma explosão nuclear.
